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免疫细胞治疗是一种新兴的肿瘤治疗方式，已成为恶性肿瘤治疗研究的热点领域。自2010年首次进入临床， CAR-T疗法备受关注，在治疗血液系统恶性肿瘤、尤其是复发难治性淋巴瘤上展现了极大的优势，成为科研和医疗圈的热点。2021年，两款CAR-T疗法在国内获批上市。2022年，第一款完全国产的CAR-T细胞治疗产品获得FDA批准上市，我国也迈入了细胞治疗的商业化时代。
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CAR-T技术原理
CAR-T（Chimeric antigen receptor T cell），嵌合抗原受体T细胞疗法，是指人为地给正常T细胞加入（嵌合）特定抗原的受体，以使T细胞行使特异的杀伤功能。当这个抗原为癌细胞表面的抗原时，T细胞就可以特异地和癌症细胞结合，从而通过细胞杀伤作用对癌细胞进行杀伤。在临床上，CAR-T细胞治疗首先需要采集患者的外周血收集T细胞。T细胞通过病毒载体转入特定的CAR基因，并在体外进行刺激扩增，随后CAR-T再回输给患者，在患者体内行使其被设定的肿瘤杀伤作用。
图 1 CAR-T细胞疗法的临床操作
和T细胞类似，CAR-T细胞和肿瘤细胞通过免疫突触结合后会通过三种机制来对肿瘤细胞进行杀伤。
第一，CAR-T细胞分泌穿孔素和颗粒酶，穿孔素可以在肿瘤细胞表面“打洞”，随后颗粒酶被输送到肿瘤细胞内部，直接通过物理作用对肿瘤细胞进行杀伤或者诱导肿瘤细胞发生凋亡；
第二，CAR-T细胞表面还会高表达TNF配体，这些配体可以诱导肿瘤细胞凋亡；
除以上两种机制外，CAR-T细胞还会分泌特定的细胞因子，因此这些细胞可以促进CAR-T的活性，改变肿瘤微环境，进一步增强其抗肿瘤活性。
图2 CAR-T细胞通过三种机制杀伤肿瘤细胞示意图
CAR-T发展历程
CAR-T细胞主要由三部分组成，即胞外区、跨膜区和胞内区域，由抗体的单链可变区域（scFv)与T细胞表面受体嵌合于T细胞上。胞外区常为单链抗体（scFv)，负责识别并结合靶抗原；跨膜区是铰链或间隔区，可将scFv锚定于细胞膜上；胞内信号域由共刺激因子和CD3信号域组成。当抗原被识别和结合后，产生刺激信号传至胞内信号域，T细胞被激活并发挥效应功能。
图 3 CAR-T细胞基本结构
第一代CARs由胞外抗原识别区即单链可变片段（scFv）组成，融合跨膜区和T细胞受体（TCR）CD3ζ 分子胞内信号域。然而，由于一代CAR-T细胞扩增慢和持久性差，在临床试验中疗效甚微。
第二代CARs包含一个共刺激域，其衍生自CD28或4-1BB结构域，位于跨膜区和CD3信号传导域之间。Carl H. June 团队在第一代CAR-T的基础上设计了以CD19为靶点，4-1BB做共刺激结构域的第二代CAR-T。其衍生产品在2017年获FDA批准，成为全世界第一个上市的CAR-T产品。
第三代CARs使用了慢病毒作为转染载体，可携带更大的基因片段进入T细胞。第三代CARs 在胞内信号结构域加上了第二个共刺激分子，增强T细胞信号转导，后续发展了多代CAR分子。
图 4 三代CAR-T结构设计
第四代CAR-T细胞，也称为精准CAR-T细胞，结构设计主要从肿瘤等疾病的精准治疗角度考虑。设计思路包括为CAR-T细胞设计一个安全开关，在CAR的胞内部分插入一个光开关蛋白LOV2；在CAR的结构中添加自杀基因或者可控性自杀基因（例如某些药物敏感基因），从而实现对CAR-T细胞在体内存货时限的可控；添加细胞因子或者趋化因子受体结构，从而增加T淋巴细胞在肿瘤组织中的浸润，达到增强杀伤实体瘤的效果。
为了克服目前CAR-T成本高，制备周期长，只能采用自体细胞制备等问题，通用型CAR-T（UCAR-T，第五代CAR-T）已成为未来重点的发展方向。目前第五代CAR-T尚处于早期临床阶段。通用型CAR使用BBIR CAR（生物素结合免疫受体）或SUPRA CAR（split、universal、programmable）这两种“第三方”系统，拆分胞外抗原靶向结构或T细胞信号单位，以赋予CAR-T细胞识别多种抗原能力。同时，从同种异体健康受体获取的T细胞，可在体外通过基因编辑技术（ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9）破坏T细胞的TCR基因和HLA Ⅰ类基因，克服移植物抗宿主病（IGvHD）。
行业情况
截止到2022年6月，全球已有八款CAR-T疗法产品获批上市（表1）。2017年8月，诺华公司研发的Kymriah疗法获得FDA批准用于治疗患急性B淋巴性白血病且病情难治或多次复发的25岁以下患者，成为全球第一个获批的CAR-T疗法，开启了肿瘤免疫治疗新篇章。
2021年6月22日，复星凯特CAR-T细胞治疗产品益基利仑赛注射液已正式获得批准，标志着中国迎来首款获批上市的CAR-T细胞治疗产品，也是中国首款获批上市的细胞药物。2021年9月3日，药明巨诺靶向CD19的CAR-T产品阿基奥仑赛注射液获批，适应症为用于治疗经过二线或以上系统性治疗后成人患者的复发或难治性大B细胞淋巴瘤（r/r LBCL）。这是国内第2款获批的CAR-T产品，同时也是全球第7款获批的CAR-T产品。
2022年2月，由强生（Johnson ＆ Johnson）旗下杨森公司（Janssen）和传奇生物合作开发的BCMA CAR-T产品西达基奥仑赛（cilta-cel）获得美国FDA批准上市，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤成人患者（MM），成为FDA批准的第二款靶向BCMA的CAR-T疗法。
表 1 全球已上市CAR-T产品
全球范围内的CAR-T疗法行业竞争依然激烈，Clinical Trail上有370余项CAR-T临床试验进入Ⅰ期、Ⅱ期阶段。国内布局CAR-T进入临床阶段的企业超过20家，CD19、BCMA依然是热门靶点，形成差异化竞争的科济药业和传奇生物也有布局针对实体瘤的CLDN-18.2等靶点。
图 5 国内主要CAR-T企业进展情况
目前，关于CAR-T治疗的研究已经不仅限于血液系统肿瘤，在如肺癌、肝癌、肠癌等实体肿瘤领域已经取得了一定的突破。相信CAR-T疗法在未来将突破毒副作用、T细胞衰竭等限制，实现疗效更好、安全性更高、副作用更低同时价格也更实惠的细胞免疫疗法。
未来发展方向
目前CAR-T细胞治疗还存在脱靶效应、细胞因子风暴、神经毒性等主要毒副作用。同时，根据Allogene、CRISPER等UCAR-T开发领先企业的最新临床数据，UCAR-T也存在相比于自体T细胞治疗效果有所折减，长期疗效表现不尽人意的问题。UCAR-T疗效打折很大一部分原因是机体对供体T细胞的清除。为了克服以上的缺点，CAR-T疗法加速了在寻找肿瘤新靶点、研究信号机制和开发新技术方面的步伐。
一.在结构设计方面。新一代CAR为了克服CAR-T丢失精准性的效应，如图6所示涌现了多种思路。例如双(多)靶CAR-T细胞：可以在T细胞表面表达识别两(多)种不同肿瘤抗原的抗原受体结构（scFv），防止由于肿瘤抗原丢失引起的肿瘤细胞逃逸。基于抗体的开关设计（通用CAR-T）:只有识别特异抗原的抗体结合到CAR上，T细胞才会被激活。syn-Notch受体CAR-T：当scFv识别抗原后，进一步诱导表达识别另一个抗原的CAR，当肿瘤细胞同时表达这两种抗原的情况，T细胞才会被激活等等。
图 6 新一代CAR-T的不同设计示意图
二.在拓展适应症方面。目前，Car-T 在血液瘤的研究相对较为成熟，全球开展了大量临床试验探索 CD19外的新靶点。目前有应用价值的针对恶性 B 细胞肿瘤的临床前和临床靶标还包括CD22、CD20,ROR1,CD37、BCMA等。
与血液瘤相比，实体瘤CAR-T的开发难度更大，难点包括抗原异质性强缺乏理想的靶点、需要克服肿瘤微环境的免疫抑制、CAR-T细胞在实体瘤微环境下转运和浸润能力差、内源性T细胞抑制信号降低CAR-T活性等。2016年，Claudin18.2靶向的人鼠嵌合IgG1单抗药物Zolbetuximab（IMAB362）展示了治疗晚期胃癌的临床数据，Claudin18.2成为了国内外胃癌、胰腺癌抗体药物治疗的热门靶点。2022年3月，科济药业CT041进入确证性Ⅱ期临床试验，用于治疗晚期胃癌/食管胃结合部腺癌，成为全球首个且唯一进入到确证性Ⅱ期临床试验、针对实体瘤的CAR-T在研产品。未来， CAR-T技术在实体瘤方面的治疗效果值得期待。
三.通用型CAR-T产品仍然是未来CAR-T细胞治疗的重要发展趋势。一方面，更多细胞来源有待探索，包括外周血单核细胞、脐带血衍生的T细胞以及由体细胞经细胞因子诱导得来的诱导多能干细胞 (iPSC)。二是有望通过基因编辑技术克服异体来源CAR-T细胞的免疫难题。通过CRISPR/Cas技术基因敲除或破坏供体上的TCR基因，同时将负责呈递抗原的HLA类分子敲除，消除移植物抗宿主病（GvHD），降低异体来源CAR-T细胞的免疫原性，增强其杀伤、扩增活性，延长存续时间。
目前通用型CAR-T仍处于早期临床探索阶段，大部分产品为单靶点，也有部分产品布局CD19/CD22双靶向。适应症方面，除血液肿瘤领域外，通用型CAR-T疗法在实体瘤领域的开发也在摸索中，如卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌等。今年9月26日，北恒生物公布并发表了其自主研发的靶向CD7的通用型CAR-T产品RD13-01治疗血液恶性肿瘤的Ⅰ期临床结果。11名患者中，客观缓解率（ORR）为81.8%，综合缓解率（MRD-CR/CRi）为63.6%，整体表现出较好的安全性和有效性。10月，亘喜生物靶向 CD19 的异体CAR-T产品GC007G注射液进入治疗复发/难治性急性 B 淋巴细胞白血病的Ⅱ期临床阶段。未来随着新技术的开发，通用型CAR-T疗法有望上市，通过大批量生产降低CAR-T细胞成本，惠及更多患者。
总而言之，CAR-T疗法的发展，在“深度”和“宽度”上都有着更多有待探索的创新方向。一方面是CAR-T本身技术的更迭和创新，通过合成生物学和基因编辑技术对CAR结构不断设计、优化，以及对多种抗肿瘤效应细胞进行开发。另一方面，随着CRISPR基因编辑技术、iPSC、mRNA等技术不断更迭发展， CAR-T疗法与创新技术的结合有极大的应用空间等待挖掘，在靶点、适应症等方面取得突破。
随着更多技术难题别攻克，期待未来CAR-T疗法在更多治疗领域进行推进，在商业化阶段进行推广，从末线治疗走到前线治疗，给癌症治愈带来更多希望。
